La unión extremadamente estrecha entre la biotina y la avidina o la estreptavidina hace que el etiquetado con biotina de las proteínas sea una herramienta útil para muchas aplicaciones. BirA es la biotina ligasa de Escherichia coli que biotinila en un sitio específico una cadena lateral de lisina dentro de un péptido aceptor de 15 aminoácidos (también conocido como etiqueta Avi).

Como enfoque complementario a la biotinilación in vivo de proteínas con etiqueta Avi, desarrollamos un protocolo para producir BirA ligasa recombinante para la biotinilación in vitro. La proteína objetivo se expresó como fusiones de tiorredoxina y MBP y se liberó de la fusión correspondiente mediante la proteasa TEV. La ligasa liberada se separó de su portador utilizando una columna HisTrap HP.

Stepped Micro Tip (includes Interface Washers)

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Tapered Micro Tips

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Tapered Micro Tips 5 mm Diameter Tapered Titanium Micro Tip

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10 mm Diameter Solid Titanium Tip

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Se obtuvieron 24,7 y 27,6 mg de BirA ligasa por litro de cultivo a partir de las construcciones de fusión de tiorredoxina y MBP, respectivamente. La enzima recombinante demostró ser muy activa para catalizar la biotinilación in vitro. El protocolo descrito proporciona un medio eficiente para la fabricación de BirA ligasa que puede utilizarse para la biotinilación de diferentes sustratos con etiquetas Avi.

La extensión de la tecnología de avidina-biotina (strepto) para la purificación total de proteínas, el desarrollo de biochips reutilizables y biorreactores de enzimas inmovilizadas, la inmovilización selectiva de una proteína de interés a partir de una muestra cruda a una matriz proteica libre de proteínas purificación y muchas otras aplicaciones posibles, la interacción avidina-biotina (estreptococo) es mejor cuando es reversible.

Stepped Micro Tip (includes Interface Washers)
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Tapered Micro Tips
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Tapered Micro Tips 5 mm Diameter Tapered Titanium Micro Tip
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Se ha desarrollado un método para introducir un análogo de la biotina, la destiobipotina, de forma específica para cada sitio en proteínas recombinantes que llevan una etiqueta de biotinilación. Se ha establecido la condición óptima para la destiobinilación in vitro catalizada por la biotina ligasa eYcient (BirA) de Escherichia coli in It, de 1 a 4 h, variando sistemáticamente las concentraciones de sustrato, el tiempo de reacción y el pH.

La destiobiotinilación real en La ausencia de cualquier biotinilación significativa utilizando este método enzimático fue confirmada por el análisis de espectrometría de masas de la etiqueta destiobiotinilada. Este método se aplicó para purificar la estafilocinasa destiobinilada aYnidad secretada por el Bacillus subtilis recombinante con una alta pureza y una buena recuperación utilizando estreptavidina-agarosa. La matriz puede regenerarse para su reutilización. Este estudio representa la primera aplicación exitosa de E. coli BirA para incorporar análogos de biotina en proteínas recombinantes en un sitio específico.
conducta.

Fuentes
1. ¿Qué es la parafina?
2. Gentaur
3. NCBI